基因测序可以说是这些年生物学中发展最为迅速的一个技术。科学家们称如果完全掌握了基因测序，无异于掌握了改变世界的技术。可想而知这个课题研究是多么的厉害。那么pcr与基因测序有什么区别?基因测序常见问题有哪些?一起来看看吧。

 

　　pcr与基因测序有什么区别？

 

　　pcr与基因测序的区别是聚合酶连锁反应 (polymerase chain reaction,PCR)能以酶促反应的方式使位于两段寡聚核苷酸顺序之间的DNA片段特异性扩增上百万倍。其重要用途之一就是从克隆的DNA片段中或 直接从基因组DNA中制备测序模板。为了避免线状双链模板在测序反应中复性,一般使用单链DNA(ssDNA)模板。它可直接由PCR制备,也可用酶处 理,电泳分离或亲和纯化等方法直接从双链DNA(dsDNA)制备。PCR与测序的结合使得扩增和测序两反应能在同一试管中进行。如果终止核苷酸或测序引 物带有荧光标记,则整个程序还可望完全自动化。

　　转录组学的研究对象包括mRNA和非编码RNA等。新一代高通量测序技术可以全面快速地获得特定细胞或组织在某一个状态下几乎所有转录本的序列信息和表达信息，从而准确地分析基因表达差异、基因结构变异、筛选分子标记(SNPs或SSR)等生命科学的重要问题。

 

　　基因表达谱测序是直接对某一物种或特定细胞在某一功能状态下产生的mRNA进行高通量测序，可以用来研究基因的表达差异情况。该技术结合了转录组测序建库的实验方法，与转录组测序相比，基因表达谱测序要求的读长更短，测序通量更小，但仅可用于基因表达差异的研究。

 

　　转录组测序是RNA水平测序，相当于DNA水平的基因组测序，是一个框架。表达谱主要研究的是基因表达量的变化，上调或下降。先要有转录组或是基因组才可以做表达谱，否则没有Ref做参考。

　　转录组测序和表达谱测序其实都是通过高通量测序技术进行的，转录组测序主要是针对没有参考基因组(即基因组未完成测序)的物种，侧重于获得你材料的全部转录组信息;而表达谱则侧重于检测各个基因的表达量。

 

　　基因测序常见问题分析

　　1、为什么找不到PCR引物?

 

　　答：以下几种情况，将无法找到做PCR时的引物序列

 

　　(1)用PCR引物作为测序引物进行测序时，所测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以自然就找不到您的引物序列了。有两种方法可以得到您的引物序列。对于较短的PCR产物(<800bp)，可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测到序列的末端，就可以在序列的末端得到您的引物的反向互补序列。对于较长的序列，一个测序反应测不到头，因此就只能将您的PCR产物片段克隆到适当的载体中，用载体上的通用引物进行测序。由于载体上的通用引物与您的插入序列之间还有一段距离，因此就可以得到您的完整的引物序列。由于在测序的起始端总会有一些碱基无法准确读出，因此，您如果想得到您的PCR产物的完整序列，最好克隆后进行测序。

 

　　(2 PCR产物用T载体克隆后，由于克隆的方向是随机的，因此，当您在一条链上找不到您的引物序列时，试图在互补链上寻找您的引物序列。

 

　　(3)当测序引物离您的插入片段很近时，有时可能也无法找到您的引物的全序列。这主要是因为有时测序的起始端由于未去除的染料或引物二聚体的干扰，造成起始区的序列不好，可能无法找到您的引物完整序列。

　　(4)有时，质粒做模板进行测序时，由于某些原因，质粒上没有插入外援片段，为空载体，所测的序列完全为载体序列，此时自然也找不到引物序列。

 

　　2、DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?

 

　　答：溶解DNA测序样品时,用灭菌蒸馏水溶解最好。DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应,需要一个最佳的 酶反应条件.如果DNA用缓冲液溶解后,在进行了测序反应时,DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件,造成Taq酶的聚合性能下降。有人溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。的确，TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性，但TE Buffer对DNA测序反应有影响，根据经验，推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。

 

　　3、提供DNA测序样品时，提供何种形态的比较好?

 

　　答：推荐客户提供菌体，由测序公司来提取质粒，这样DNA样品比较稳定。如果自己提供DNA样品，我们也很欢迎，但一定要注意样品纯度和数量。提供的测序样品为PCR产物时，特别需要注意DNA的纯度和数量。PCR产物应该进行切胶回收，否则无法得到良好的测序效果。有关DNA测序样品的详细情况请严格参照“测序模板的要求”部分的说明。

 

　　4、怎样选择(设计)测序用引物?

 

　　答：测序用引物要求非常严格，不同于PCR用引物。PCR用引物一般只要能和模板结合，3’端的几个碱基能完全配对，即使引物长达80～100多个碱基，只要调整PCR反应条件，也能成功进行PCR反应。而测序用引物便不一样了，必须严格符合以下要求。

　　(1)长度在15～25个碱基左右，一般选择20个碱基(根据GC含量作适当调整)，

 

　　(2)3’端尽量选择G或C碱基(但不绝对)，以增加与模板的结合能力。

 

　　(3)Tm温度应选择50℃～70℃左右。

 

　　(4)GC含量应选择在50%左右，尽量避开A、T、G、C的连续结构。

 

　　(5)避开引物自身形成发夹结构或引物二聚体结构等复杂结构。

 

　　(6)保证引物和模板100%匹配，特别是3’端的几个碱基一定要100%匹配。同时必须严格保证引物和模板之间只能有一个结合位点。

 

　　5、提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好?

　　答：一般菌体的形态有：平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌或新鲜菌液等。我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。平板培养菌运送特别不方便。而甘油保存菌则容易污染。制作穿刺菌时，可在1.5ml的Tube管中加入琼脂培养基，把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基(固体)中，37℃培养一个晚上后便可使用。穿刺培养菌在4℃下可保存数个月，并且不容易污染，便于运送。

 

　　6、与测序引物有关的问题：

 

　　答：对于通用测序引物，只要正确使用，一般不会有太大问题，测序引物问题主要发生在客户自己提供的PCR引物上。应该明确的一点是并不是所用的用于PCR的引物都可以用来作测序，以下几种PCR引物将是不适合用作测序引物的：

 

　　(1)简并引物，简并引物必然要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果。

 

　　(2)随机引物，如RAPD引物，随机引物一般都比较短，所用退火温度低，在测序反应的条件下，不能很好地与模板结合。

 

　　(3)过长的引物，一般要求测序引物不大于24bp，最长不能超过30bp。

　　过长的引物在测序反应的较低的条件下容易在测序模板上有多个结合位点，导致测序结果背景增高。另外，较长的引物纯度也将难以保证。通常用于测序的引物纯度要在90%以上，引物纯度低时，测序反应的背景将明显增大，直接影响到测序结果。

 

　　(4)有特殊标记的引物，

 

　　该情况主要指荧光标记的引物。我们测序反应的四种碱基都是荧光标记的，这样，荧光标记的引物将产生干扰。另外，其他一些有大的标记基团的引物也最好不要用于测序。引物上大的标记基团将直接影响到DNA片段的迁移率，导致测序结果峰型不好或错误。

 

　　(5)不纯的引物，

 

　　测序引物对纯度的要求很高，合成的引物中非全长的片段可以造成较强的背景。以一个20bp的测序引物为例，直接脱盐纯化的话，纯度至多在70%左右，也就是说将有30%的引物将作为背景噪音，这必将严重影响测序结果。一般经PAGE或OPC法纯化的引物基本能达到测序的要求。

 

　　7、PCR片段直接测序和PCR片段经克隆后测序的结果有何区别?

　　答:众所周知，PCR圹增过程中会出现很多错配现象，但不可能所有的错配都发生在同一位置。PCR片段直接测序时，其结果是PCR片段众多分子的混合物的结果。如果在某一个点上出现了几十次错配现象，但大多数分子(或许是几十万个分子)在这个点上应该还是正确的，在测序时，错配现象也就是反映不出来了。因此，PCR片段直接测序的结果反映的是PCR用模板最原始的结果。而PCR片段经克隆后测序是测定了某一个分子的DNA序列。在几十个循环的PCR扩增过程中，很难保证某一个分子的任何点都不发生错配。因此，PCR片段经克隆后的测序结果，往往存在着一些错配的序列，和PCR片段直接测序的结果相比有些碱基会有所不同。这种错配现象的多少取决于PCR扩增时使用的DNA聚合酶的保真性能。要减少PCR扩增过程中的错配现象，在PCR反应时，请选用保真性能高的DNA聚合酶。

 

　　8、出现套峰的原因是什么?

 

　　答：在测序反应中，模板或引物的原因都可能造成套峰的形成，归结其形成原因有以下几点：

 

　　(1)测序引物在模板上有两个结合位点形成套峰;

 

　　(2)模板不纯，如果是质粒或是菌液，原因是非单克隆，如果是PCR,原因为非特异性条带;

 

　　(3)模板序列的特殊结构，如poly结构、发卡结构等;

 

　　(4)引物降解，引物不纯，或引物的特异性不好。

 

　　9、基因序列与标准序列为什么有差别?

 

　　答：一段基因序列经扩增后，克隆到载体中进行测序。在两个层次上可能导致序列发生变化。首先在PCR扩增过程中就可能产生错误。将片段克隆到载体中也有可能发生突变。其次，测序的准确率问题。由于仪器准确率的限制，在一个较长的序列中发生碱基序列错误是难以避免的。在确认克隆无误的情况下，通过双向测序可以最大限度

 

　　减少测序的错误。如果想得到您的最准确的序列，进行双向测序是很有必要的。只进行简单的单向测序，无法保证所测序列的完全准确性，这是由仪器的精度决定的。

　　10、过短的PCR产物为什么不适于直接测序?

 

　　答：首先过短的PCR产物纯化困难，一般的PCR产物纯化试剂盒都要求PCR产物片段大于150bp，过短的PCR产物纯化和准确定量都非常困难。因此我们要求用于测序的PCR产物一般不低于150bp长度其次，由于测序技术本身的限制，测序反应对环境的干扰比较敏感，模板太短的PCR测序受外界的干扰更大，很容易造成测序失败。

 

　　11、用测序的方法检测点突变可靠吗?

 

　　答：该方法可靠性不高。主要有以下两个原因。首先，测序公司并不清楚突变的序列与正常的序列的比例是多少。测序反应的信号强度直接与模板的量有关，如果突变的模板所占的比例很少，将直接作为背景噪音了，很难检测出来。只有当测序反应体系中正常的和突变的模板量比较接近时，才能较可靠地检测到突变体的存在。其次，在同一位置，不同碱基的信号强度一般是不一样的。这样即使突变的模板所占的比较较高时，也不一定能准确检测到突变的存在。另外，测序仪是设计用来测序正常的碱基序列的，软件在对扫描的结果进行处理时，会尽量提高主峰而将背景信号尽量压低，以得到尽可能好的结果。因此，当某处出现双峰时，测序仪一般会认为信号弱的峰为背景信号，在处理过程中，将弱的峰进一步压低，这样根部不立于突变体的检测。因此认为，用测序的方法检测突变体的存在不是一个好的方法。

 

　　12、样品送测序前已经鉴定过了，有插入片段的，为什么测序结果是一个空质粒?

 

　　答：造成这种现象主要有两个原因。

 

　　(1)鉴定过程中的假阳性。鉴定插入片段主要是通过PCR和酶切两种方式鉴定。由于PCR反应受多种条件的影响，在鉴定过程中易产生假阳性，而酶切鉴定是比较可靠的鉴定方式。

　　(2)测序公司由于条件的限制，无法单独的对某一个客户的样品进行特定条件的培养，所以可能在培养过程中发生插入片段的丢失。直接提供质粒虽然可以避免这样的情况，但由于质粒制备上的问题，测序的成功率可能会受到影响。

 

　　13、DNA片段很长，一个反应读不到头，怎么办?

 

　　答：如果DNA片段在载体上，可以用载体上两端的引物同时测序，让其中间交叉互补，便可完全测通。如果这样还读不通，可在已经测出序列的450～500个碱基处设计测序引物作进一步测序(此称为PrimerWalking法)，便可完全测序。

 

　　14、样品已经测通了，但为什么在overlap区有这么多的错配，测序公司给出的全序列和单个报告也称作差异，我该相信谁?

 

　　答：测序公司给出的全序列应该是一个拼接的结果，当互相拼接的两个序列存在差异时，应该以序列质量更好的应该为主，这也就是为什么会出现错配和全序列与单个测序结果的差异。